黑线仓鼠无冬眠现象。一般在8周龄时性成熟，最适应繁殖年龄是12周龄。发情周期是3~7天（平均4.5天）。发情周期可分为发情前期、发情期、发情后期和间休期。发情前期持续半天左右，阴门粘膜呈粉红色或红色，湿润而松弛，易拔开，此期雌、雄鼠愿意接近，雌鼠往往围绕着雄鼠转。发情期阴门进一步充血，呈暗红色，阴蒂呈深红色或紫红色，此期雌鼠活动频率，常常翘尾，很容易交配。雌鼠发情期一般出现在黄昏，如果人工控制光照，变黑暗后2~3小时即可发情。发情后期雌鼠的阴门和阴蒂充血、肿胀很快消失，雌鼠不再翘尾，雌、雄经常发生咬架。间休期阴道口略微开口或封闭，阴门变枯燥、苍白，此期雌鼠变得很凶。黄昏至晚10时进行交配受孕率高。
黑线仓鼠的妊娠期为20~21天，平均20天14小时。哺乳期21天。产仔雌雄比例为47.4：52.6。初生仔鼠重1.5~2.5克，成年鼠达30~40克，初生仔数无毛、闭眼，3~4日龄长被毛。7日龄全身蒙上被毛，10~14日龄睁眼、有听觉。1月龄雄鼠睾丸从腹腔降至阴囊。黑线仓鼠寿命为2~2.5年。
黑线仓鼠表现出明显的季节性繁殖特征，春、夏季繁殖，冬季停止。每年3~4月和8~9月出现两个繁殖高峰。每年繁殖3~5胎，每胎平均4~9只幼仔，但以6只居多。第一次繁殖高峰产的鼠大部分当年参与繁殖，后期出生的鼠越冬后才参与繁殖。
