一战期间，弗莱明在皇家陆军医疗队服役，他在赖特教授的带领下在法国布洛涅建立的临时实验室研究伤口感染。弗莱明发现，当时常用的防腐剂弊大于利，因为它们对人体免疫物质的影响远远超过了它们分解有害细菌的能力，而更多士兵其实是死于防腐治疗。弗莱明建议停用防腐剂，只需保持伤口干燥和清洁即可。然而，他的建议没有得到重视。战后，弗莱明回到圣玛丽医院继续他的研究。
1928年2月13日，弗莱明和家人回到实验室，他漏掉的金黄色葡萄球菌培养物被一种霉菌（后来被鉴定为青霉）污染了。他还发现这种霉菌周围的葡萄球菌菌落已被破坏。弗莱明以为找到了一种比溶菌酶更有效的酶，后来，他发现那根本不是酶，而是抗生素
他后来谈到这一事件时说：“黎明醒来时，我想我当时并不打算通过发现世界上第一种抗生素或细菌杀手来彻底改变当时的医学。但我确实做到了。”他起初称这种物质为“霉菌汁”，然后以生产它的霉菌命名为“青霉素”。
