丙酮酸羧化酶。糖酵解途径中有3个不可逆反应，在糖异生途径中须由另外的反应和酶(为糖异生的关键酶)代替。丙酮酸经丙酮酸羧化支路变为磷酸烯醇式丙酮酸：糖酵解途径中磷酸烯醇式丙酮酸由丙酮酸激酶催化生成丙酮酸。
在糖异生途径中其逆过程由两个反应组成：催化第一个反应的是丙酮酸羧化酶，其辅酶为生物素。反应分两步，CO2先与生物素结合，需消耗ATP，然后活化的CO2再转移给丙酮酸生成草酰乙酸。第二个反应由磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶催化草酰乙酸转变成磷酸烯醇式丙酮酸。
反应中消耗一个高能磷酸键，同时脱羧。上述两步反应共消耗2个ATP。b.1，6-二磷酸果糖转变为6-磷酸果糖：由果糖二磷酸酶1催化。6-磷酸葡萄糖水解为葡萄糖：由葡萄糖-6-磷酸酶催化。
