如下图所示为宽场显微镜光路图。
由光源发出的激励光首先经过一个激励光滤波片（Filter），这个滤波片仅允许荧光体所需波长部分的激励光光通过，除去其他波段的杂波。经过输入滤波片后的激励光由二向色镜（Dichroic Mirror）反射进入物镜后聚焦于样本处。当激励光照射到样本后，荧光体会产生波长更长的荧光信号。一部分进入物镜的荧光信号会穿过二向色镜，再经过一个滤光片后，滤除含有的激励光杂波，将经过滤波后的荧光信号输入至目镜或相机并成像。在这个成像系统中，激励光和荧光均经过同一个物镜，称为“Epifluorescence”。系统中两个滤波片和二向色镜的作用是滤除各个光路中的杂波，提高荧光成像清晰度。
现阶段在宽场荧光显微镜中最常用的光源是发光二极管（Light Emitted Diodes，LED），LED光源可以精确控制输出激励光的波长和强度，成本低，寿命长，产热低，结构紧凑，光路准直性要求低。这些特性使得LED成为宽场荧光显微镜中最常用的光源。相比之下，水银汞灯（Mercury arc-lamp）光源在一些给定波长具有更高的输出功率，但是使用寿命较短，在发光时会产生额外热量，输出强度较高更容易产生光漂白（Photobleaching）和光毒性（Photoxicity），同时还存在重金属泄露的风险。
成像时，可以通过目镜肉眼直接观察样本的荧光成像，也可使用相机进行图像采集。相机中的光电传感器由光电二极管阵列组成，这些光电二极管可以将光信号转换电流信号。最常用的两种光电传感器为CCD（Charge Coupled Devices）和CMOS（Complementary Metal Oxide Semiconductors），根据不同的帧率、噪声和灵敏度要求选择不同的光电传感器。
