采用高压灭菌，每次使用前必须向锅内加水，加入量以达到水位标记为度。切忌空烧或加水不足导致中途烧干而引起爆炸事故。
放入锅内灭菌的培养基、物料等，排放时需留有缝隙，使蒸汽畅通。
如果叠放得过于紧密，将阻碍蒸汽穿透，造成物料内外温度不均匀，形成“死角”，致使灭菌不彻底。
加热灭菌时，先打开排气阀，使锅内冷空气排出，当水沸腾时，大量蒸汽从排气阀中冲出，冷空气被排尽，即可关闭排气阀。
若灭菌锅内冷空气未排尽，则它受热后很快膨胀，压力上升，使压力与温度形成差异，这时虽然压力达到，而温度达不到规定的要求，产生压力虽高而实际灭菌温度低的假压现象，致使灭菌不彻底。
排除冷空气也可采用集中排气法，即当压力达到0.049兆帕时打开排气阀排气，压力降到零再关闭排气阀升压灭菌。
后一种方法只适合器皿、刀具、棉织物、口罩等，而料瓶、料袋，特别是液体培养基等不宜采用。
因为容易造成袋膜胀破、瓶塞脱落、液体沸腾外溢。
灭菌结束后，一般应自然缓慢降压。
若排气太快锅内产生负压，瓶、袋内压力大于锅内压力，这与集中放气一样会造成料袋鼓气膨胀而拉薄胀破或液体外溢等情况发生。
