伦琴最大的贡献当然是发现X线。说起来他发现X线还有一段故事。1861年，英国科学家威廉·克鲁克斯发现通电的阴极射线管有放电产生的光线。于是就把它拍下来。可是显影后发现整张干版上什么也没照上，一片模糊。
他认为干版旧了，又用新干版连续照了三次，依然如此。
克鲁克斯的实验室非常简陋，他认为是干版有毛病，退给了厂家，就这样，一个伟大的发现与他失之交臂。
20多年后的1895年10月，伦琴也发现这个现象，他决心查个水落石出。年过半百的伦琴吃住在实验室，一连做了7个星期的秘密实验。11月8日，他用黑纸把阴极射线管严密地包起来，只留下一条窄缝。
这次他发现电流通过时，两米开外一个涂了氰亚铂酸钡的小屏发出明亮的荧光。
伦琴证明了这种效应是一种看不见的射线引起的，它能穿过纸和2--3厘米厚的木头，能穿过薄铝片，但不能穿过较厚的金属和其他致密物质。
如果把手放在管子与荧光屏之间，可以看到手上的骨骼。12月28日，他宣布了自己的新发现，并将这个性质不明的射线叫做X射线。后人将X线以他的名字命名，成为伦琴射线。以X线为基础产生了X线学，也称为伦琴射线学（roentgenology）。
