《办法》共6章38条，包括总则、行车组织基础、正常行车、非正常行车、施工行车、附则等章节。主要内容有：
一是明确了行车组织工作的基本要求。要求运营单位合理制定行车计划，确保各设施设备系统运行能力，保障行车组织需要，充分满足客流需求，并持续改进和优化；列车运行图的编制既应经济合理地运用车辆和安排施工维修时间，有效发挥线路能力，又要保持相对稳定，确保满足安全运营条件。《办法》针对城市轨道交通行车指挥层级、行车方向、列车等级、行车调度命令、行车组织方法等方面作出原则规定，统一行业行车组织的基本规则。其中，重点对各种行车组织方法的行车凭证和安全防护等内容提出要求，着力保障行车安全。
二是规定了正常情况下基本的行车组织规则。按照行车组织程序，对运营前准备、乘务组织、车站行车监控和运营结束等方面的安全作业作出规定。明确运营前应做好各项准备确认线路安全后方可开始营运；规定驾驶员单次值乘的最大时长和连续值乘最小间隔，强调运营单位应在出勤时对驾驶员状态进行检查，保障驾驶安全；提出驾驶员开关门作业时的操作要点，严防夹人夹物动车；规定车站行车人员要做好行车监控，特别是特殊情况下的安全监控及应急处置；提出共线、跨线运行方式下行车调度和异常情况处置的原则；明确了车辆基地调车、试车作业时的安全防护要求。
三是规定了非正常情况下的行车作业规则和安全防护要求。明确发生突发情况时，应在保证行车安全前提下尽可能维持列车运行；分别规定了抢修施工作业、列车限速运行、越防护信号机禁止信号、列车自动防护失效、列车退行、列车越站、反方向行车、列车救援、道岔故障、联锁失效、接触网（轨）失电、区间乘客疏散等典型非正常行车场景，以及发生地震、恶劣天气、公共安全事件等特殊情况下的行车调度程序、安全作业规则、安全防护要求等，最大程度保障人员安全和行车安全。
四是明确了施工作业的行车组织规则和安全防护要求。要求运营单位应合理安排并严格执行施工作业计划，施工作业原则上不应影响正常运营；发生故障影响运营时，应按照“先通后复”的原则视情安排施工作业。对于设施设备调试、升级、更新改造等重大施工，应制定并组织落实行车保障措施。对于施工列车与相邻施工区域间隔、工程车施工作业、人员与工程车同时作业等方面明确了安全防护要求，从施工行车组织角度保障施工安全。
